《刺客信条》系列的特色在于逼真的历史环境以及奔放自在的跑酷／自由奔跑（Pakour／Free Running）之移动方式，让玩家在生动的城市景观里奔跑、跳跃与攀爬，并施展出各种华丽的暗杀与战斗招式。 《刺客信条：兄弟会》以前作尾声惊鸿一瞥的罗马为舞台，让Ezio与圣殿武士旗下的Borgia家族展开大规模的冲突。
《刺客信条：兄弟会》以文艺复兴时期的罗马为首要舞台。在主线剧情之外，游戏拥有大量的开放式内容、收集要素、探索区域与旁支任务，让玩家可尽情体验虚拟的历史罗马。
身处现代的Desmond在《刺客信条：兄弟会》里也有不少戏份，玩家可以操作Desmond与其他人物互动，并探索Eizo的庄园古城。
游戏的操作方式与前作相同，玩家可以用左类比杆移动主角，并配合按键做出跳跃、攻击与暗杀的动作；玩家若以缓慢步行的方式混进人群里，还可以假装成群众的一员避开首卫的监视。如果玩家需要迅速移动，按住RT键不放就能让Desmond／Ezio开始奔跑并自动跃过小型的缺口或在栏木上连环跳跃，配合玩家手动输入跳跃指令，可以让Ezio轻松地攀上墙壁，在楼房高台间穿梭自如。遭遇刺杀目标时，玩家也可以选择潜行侵入来个无声刺杀，或是大剌剌地从正门杀入，用蛮力强行达成目标。
玩家在战斗中可以利用各种兵器进行战斗，包括火铳与十字弓等等。玩家也能反击夺下敌人的武器，以彼之兵器还治其人之身。
Eizo的造型会随玩家选定的装备而变，玩家也能为自己的部下更换服饰的颜色
